ការប្រើប្រាស់ និងការប្រុងប្រយ័ត្ននៃបំពង់ centrifuge ultrafiltration
1) ជ្រើសរើសបំពង់ ultrafiltration សមរម្យ។ចំណាំថាភ្នាស UF មានភាពខុសប្លែកគ្នានៅក្នុងកម្រិតនៃការអត់ធ្មត់របស់ពួកគេចំពោះសារធាតុគីមីផ្សេងៗ។ជាធម្មតា បំពង់ ultrafiltration ជាមួយនឹងការកាត់ទម្ងន់ម៉ូលេគុល 10 kDa អាចត្រូវបានជ្រើសរើសជាមួយនឹងការកាត់ទម្ងន់ម៉ូលេគុលដែលមិនគួរធំជាង 1/3 នៃទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីនដែលចាប់អារម្មណ៍ដូចជា 35 kDa ។ប្រសិនបើទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃប្រូតេអ៊ីនដែលចាប់អារម្មណ៍គឺប្រហែល 10 kd នោះ បំពង់ ultrafiltration ជាមួយនឹងការកាត់ទម្ងន់ម៉ូលេគុលនៃ 3 KD អាចត្រូវបានប្រើ។
(2) តម្រង ultrafiltration ដែលទើបនឹងទិញគឺស្ងួត ដោយបន្ថែមទឹកសុទ្ធមុនពេលប្រើប្រាស់ ហើយទឹកបានឆ្លងកាត់ភ្នាសទាំងស្រុង អាងងូតទឹកទឹកកក ឬទូទឹកកកទុករយៈពេលពីរបីនាទី។បន្ទាប់មក ទឹកត្រូវចាក់ចេញ ពោលគឺ ជាតិរាវប្រូតេអ៊ីន ហើយត្រូវបន្ថែមចំនួនប៉ុន្មាន ដែលមិនលើសពីបន្ទាត់ពណ៌សនៅផ្នែកខាងលើនៃបំពង់។ប្រតិបត្តិការនេះគឺស្រាល ហើយបំពង់ ultrafiltration ត្រូវការឱ្យត្រជាក់ជាមុននៅលើទឹកកក មុនពេលបន្ថែមដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីន។
3) ទាំងម៉ាស់ និងចំណុចកណ្តាលនៃទំនាញគឺត្រូវឈានដល់តុល្យភាព។ចំណាំថាល្បឿនបង្វិល និងការបង្កើនល្បឿនមិនលឿនទេ បើមិនដូច្នេះទេវាបំផ្លាញភ្នាសអ៊ុលត្រាសោនដោយផ្ទាល់។ការបន្សុទ្ធ centrifugal ត្រូវបានចាប់ផ្តើម (centrifuge precooled ដល់ 4 ដឺក្រេ) ។បន្ទាប់ពី RPM នៃ centrifuges ផ្សេងគ្នាត្រូវបានបំប្លែងទៅជា g វាខុសគ្នា។ការបង្កើនល្បឿននៃ centrifuge ត្រូវបានលៃតម្រូវទៅអប្បបរមាកាត់បន្ថយសម្ពាធលើភ្នាស។ចំណាំ សូមប្រាកដថាអ្នកចាកចេញពី centrifuge បន្ទាប់ពី centrifuge បានឈានដល់ល្បឿនគោលដៅរបស់វា ឬប្រសិនបើអ្នកមានបញ្ហា អ្នកមិនអាចដោះស្រាយវាជាលើកដំបូងបានទេ។ការតំរង់ទិសនៃភ្នាសទៅ spindle ត្រូវបានកែតម្រូវតាមការណែនាំ (ករណី centrifuge ជ្រុងគឺភ្នាសទៅអ័ក្សកាត់កែង) ។នៅក្នុងការប្រើប្រាស់ជាក់ស្តែង ល្បឿនបង្វិលទូទៅគឺទាបជាងនៅក្នុងការណែនាំ ដូច្នេះអាយុកាលរបស់បំពង់ centrifuge អាចត្រូវបានពង្រីក។
3) ទាំងម៉ាស់ និងចំណុចកណ្តាលនៃទំនាញគឺត្រូវឈានដល់តុល្យភាព។ចំណាំថាល្បឿនបង្វិល និងការបង្កើនល្បឿនមិនលឿនទេ បើមិនដូច្នេះទេវាបំផ្លាញភ្នាសអ៊ុលត្រាសោនដោយផ្ទាល់។ការបន្សុទ្ធ centrifugal ត្រូវបានចាប់ផ្តើម (centrifuge precooled ដល់ 4 ដឺក្រេ) ។បន្ទាប់ពី RPM នៃ centrifuges ផ្សេងគ្នាត្រូវបានបំប្លែងទៅជា g វាខុសគ្នា។ការបង្កើនល្បឿននៃ centrifuge ត្រូវបានលៃតម្រូវទៅអប្បបរមាកាត់បន្ថយសម្ពាធលើភ្នាស។ចំណាំ សូមប្រាកដថាអ្នកចាកចេញពី centrifuge បន្ទាប់ពី centrifuge បានឈានដល់ល្បឿនគោលដៅរបស់វា ឬប្រសិនបើអ្នកមានបញ្ហា អ្នកមិនអាចដោះស្រាយវាជាលើកដំបូងបានទេ។ការតំរង់ទិសនៃភ្នាសទៅ spindle ត្រូវបានកែតម្រូវតាមការណែនាំ (ករណី centrifuge ជ្រុងគឺភ្នាសទៅអ័ក្សកាត់កែង) ។នៅក្នុងការប្រើប្រាស់ជាក់ស្តែង ល្បឿនបង្វិលទូទៅគឺទាបជាងនៅក្នុងការណែនាំ ដូច្នេះអាយុកាលរបស់បំពង់ centrifuge អាចត្រូវបានពង្រីក។
(4) នៅពេលដែលប្រមូលផ្តុំទៅ 1ml ដែលនៅសល់ យក 50ul នៃដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្ន បន្ថែម 10ul នៃលំហូរចូល ហើយមើលថាតើមានពណ៌ខៀវឬអត់ ជាការវិនិច្ឆ័យថាតើបំពង់ ultrafiltration បាត់ប្រូតេអ៊ីនឬអត់។ប្រសិនបើបំពង់លេចធ្លាយ សូមចាក់ស្រទាប់ខាងលើម្តងទៀត ហើយហូរចូលទៅក្នុងបំពង់ថ្មី ដើម្បីចាប់ផ្តើមការចម្រាញ់ជ្រុល។ដើម្បីកំណត់ឱ្យច្បាស់ថាតើបំពង់ត្រូវបានខកខាន ឬអត់ សូមដាក់ centrifuge រយៈពេល 10 នាទីជាមួយនឹង 5mgml នៃ BSA មុនពេលលំហូរ ដំណើរការលើកាវប្រូតេអ៊ីន ឬ Bradford crude assay ហើយបន្តដោយបន្ថែមដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីនប្រមូលផ្តុំដែលនៅសល់ (ដែលដំណើរការលើទឹកកក និងការពារប្រូតេអ៊ីនពីការឡើងកំដៅ) រហូតដល់ ការផ្តោតអារម្មណ៍ទាំងអស់ត្រូវបានបន្ថែម។យកចិត្តទុកដាក់ក្នុងអំឡុងពេល centrifugation ប្រសិនបើទឹកភ្លៀងនៃប្រូតេអ៊ីនកើតឡើងដែលនាំទៅដល់ការបិទបំពង់។ប្រសិនបើទឹកភ្លៀងកើតឡើង កំណត់ថាតើមូលហេតុជាក់លាក់នៃទឹកភ្លៀងគឺជាការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនលើស ឬសតិបណ្ដោះអាសន្នមិនសមរម្យ។អតីតអាចត្រូវបានដោះស្រាយដោយការចម្រាញ់នៃបំពង់ ultrafiltration ច្រើនក្នុងពេលដំណាលគ្នា កាត់បន្ថយកំហាប់ ហើយក្រោយមកទៀតដោយការផ្លាស់ប្តូរដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្នផ្សេងៗរហូតដល់គ្មានទឹកភ្លៀងនៃប្រូតេអ៊ីនកើតឡើង។
(4) នៅពេលដែលប្រមូលផ្តុំទៅ 1ml ដែលនៅសល់ យក 50ul នៃដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្ន បន្ថែម 10ul នៃលំហូរចូល ហើយមើលថាតើមានពណ៌ខៀវឬអត់ ជាការវិនិច្ឆ័យថាតើបំពង់ ultrafiltration បាត់ប្រូតេអ៊ីនឬអត់។ប្រសិនបើបំពង់មានការលេចធ្លាយ សូមចាក់ស្រទាប់ខាងលើម្តងទៀត ហើយហូរចូលទៅក្នុងបំពង់ថ្មី ដើម្បីចាប់ផ្តើមការចម្រាញ់ជ្រុល។ដើម្បីកំណត់ឱ្យច្បាស់ថាតើបំពង់ត្រូវបានខកខាន ឬអត់ សូមដាក់ centrifuge រយៈពេល 10 នាទីជាមួយនឹង 5mgml នៃ BSA មុនពេលលំហូរ ដំណើរការលើកាវប្រូតេអ៊ីន ឬ Bradford crude assay ហើយបន្តដោយបន្ថែមដំណោះស្រាយប្រូតេអ៊ីនប្រមូលផ្តុំដែលនៅសល់ (ដែលដំណើរការលើទឹកកក និងការពារប្រូតេអ៊ីនពីការឡើងកំដៅ) រហូតដល់ ការផ្តោតអារម្មណ៍ទាំងអស់ត្រូវបានបន្ថែម។យកចិត្តទុកដាក់ក្នុងអំឡុងពេល centrifugation ប្រសិនបើទឹកភ្លៀងនៃប្រូតេអ៊ីនកើតឡើងដែលនាំទៅដល់ការបិទបំពង់។ប្រសិនបើទឹកភ្លៀងកើតឡើង កំណត់ថាតើមូលហេតុជាក់លាក់នៃទឹកភ្លៀងគឺជាការប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីនលើស ឬសតិបណ្ដោះអាសន្នមិនសមរម្យ។អតីតអាចត្រូវបានដោះស្រាយដោយការចម្រាញ់នៃបំពង់ ultrafiltration ច្រើនក្នុងពេលដំណាលគ្នា កាត់បន្ថយកំហាប់ ហើយក្រោយមកទៀតដោយការផ្លាស់ប្តូរដំណោះស្រាយសតិបណ្ដោះអាសន្នផ្សេងៗរហូតដល់គ្មានទឹកភ្លៀងនៃប្រូតេអ៊ីនកើតឡើង។
(5) ជំហានដំបូងមួយចំនួនត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីន ហើយប្រសិនបើសតិបណ្ដោះអាសន្នត្រូវផ្លាស់ប្តូរ សូមបន្ថែមបណ្តុំថ្មីដោយថ្នមៗ (អ៊ុលត្រាហ្វីលតាមរយៈភ្នាសអ៊ុលត្រាហ្វីល 0.22um) ដល់ប្រហែល 1ml នៃប្រូតេអ៊ីនសរុប ហើយប្រមូលផ្តុំឡើងវិញប្រហែល 1ml សម្រាប់បី។ ដងជាប់ៗគ្នាជាមួយនឹងបរិមាណចុងក្រោយដែលប្រមូលផ្តុំចុងក្រោយអាស្រ័យលើកំហាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលចង់បានជាទូទៅមិនលើសពី 500ul ទេប៉ុន្តែថែមទាំងក្នុង 200ul ផងដែរ។សម្រេចបាន 1000 × ឬច្រើនជាងនេះក្នុងឱកាសបី ជាសំខាន់ដូចជាការផ្លាស់ប្តូរសតិបណ្ដោះអាសន្នច្រើន ដូចដែលបានគណនាដោយការបង្កើនបរិមាណយ៉ាងហោចណាស់ 10 × ឬដូច្នេះរាល់ពេល។
(5) ជំហានដំបូងមួយចំនួនត្រូវបានប្រើដើម្បីប្រមូលផ្តុំប្រូតេអ៊ីន ហើយប្រសិនបើសតិបណ្ដោះអាសន្នត្រូវផ្លាស់ប្តូរ សូមបន្ថែមបណ្តុំថ្មីដោយថ្នមៗ (អ៊ុលត្រាហ្វីលតាមរយៈភ្នាសអ៊ុលត្រាហ្វីល 0.22um) ដល់ប្រហែល 1ml នៃប្រូតេអ៊ីនសរុប ហើយប្រមូលផ្តុំឡើងវិញប្រហែល 1ml សម្រាប់បី។ ដងជាប់ៗគ្នាជាមួយនឹងបរិមាណចុងក្រោយដែលប្រមូលផ្តុំចុងក្រោយអាស្រ័យលើកំហាប់ប្រូតេអ៊ីនដែលចង់បានជាទូទៅមិនលើសពី 500ul ទេប៉ុន្តែថែមទាំងក្នុង 200ul ផងដែរ។សម្រេចបាន 1000 × ឬច្រើនជាងនេះក្នុងឱកាសបី ជាសំខាន់ដូចជាការផ្លាស់ប្តូរសតិបណ្ដោះអាសន្នច្រើន ដូចដែលបានគណនាដោយការបង្កើនបរិមាណយ៉ាងហោចណាស់ 10 × ឬដូច្នេះរាល់ពេល។
ពេលវេលាផ្សាយ៖ វិច្ឆិកា-០៩-២០២២